裂解酵母菌的方法是將玻璃微珠和菌細胞一起渦旋振蕩進行機械破碎。此法充分利用玻璃微珠的快速轉動撞擊酵母菌從而機械破碎裂解酵母細胞。由此可見，這是一種強有力的裂解方法，但在裂解過程中又傳輸大量的能量，導致樣本的變性。因此，和哺乳動物細胞的研究比較，酵母菌的免疫沉淀試驗并不是一個好的方法，特別是研究蛋白質的性質和結構時，該方法是不可取的。
1．準備工作
由于免疫沉淀有多個步驟，且包括數小時孵育，因此在實驗開始前必須安排好時間，注意適當利用過夜孵育的間隙。這將有助于決定何時開始裂解細胞。同時應注意，
酵母菌免疫沉淀的本底水平非常高，因此推薦進行預處理和使用蛋白酶。
2．所需溶液
PBS，裂解緩沖液（含有蛋白酶抑制劑，置冰上預冷），玻璃微珠（500umol／L，冷藏）。
3．操作步驟
（1）4000g離心5min收集酵母菌，去上清液。重懸浮于PBS，離心，棄去PBS。
（2）將酵母團再次懸浮于少量預冷的裂解液。通常用大約3倍體積的RIPA緩沖液（150mmol／L NaCl、1％NP-40、0．5％脫氧膽酸鈉、0．1％SDS和50mmol／L Tris，pH8．0）。同時應加入蛋白酶抑制劑。置冰上。
（3）玻璃微珠（直徑500~mol／L），用1mol／I鹽酸和裂解緩沖液分別洗滌2次。然后置于少量裂解緩沖液內，413保存。
（4）在重懸浮的酵母細胞內加入等體積預冷的玻璃微珠。
（5）劇烈渦流振蕩30s，重復操作直至大部分酵母細胞裂解。
（6）將細胞裂解物連同玻璃微珠以10 000g離心5min。仔細吸取上清液盛于另一試管，置冰上。
此時，上清液可以用于下一步預處理。
4．常見問題
該方法常見問題是
蛋白質抗原的變性。解決方法是用某些能破壞細胞壁的酶處理酵母菌使其形成原生質體，然后再用去污劑將其裂解。這是一個有效的方法，但酶的價格昂貴，限制了該方法常規應用于大容量標本的制備。然而對于所研究的關鍵蛋白的精細分析，仍不失為一個有效的方法。
更新時間：2012-10-08
點擊次數：2070
當前位置：
